YY/T 1561-2017 组织工程医疗器械产品动物源性支架材料残留a-Cal抗原检测优质

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YY/T 1561-2017.Tissue engineering medical device products-Remnant a-Gal antigen determination in scaffold materials utilizing animal tissues and their derivatives.

裂解液配制成2 mg/mL [使用前加人1%(体积分数)1 mmol/L PMSF], 室温(25 C士5 C)放置30min~3h至样品全部裂解;将裂解后样品进行离心后取上清液备用。

5.1.4对照孔样 品

设定M86/Gal抗原阴性生物材料参考品裂解液反应样品1份作为100%的反应值;裂解液反应样品1份作为背景值。

5.2 M86 抗体孵育

5.1中每个样品分别取200μL.置于1mL离心管中,标记,每管分别加人等体积(200μL)稀释比例为1:100~1:200的M86抗体溶液(应保证M86抗体是过量的,可通过预实验确认)。混匀后在室温(25 C+5 C)温和摇动(如:100 r/min)条件下反应2 h.之后置于4 C孵育过夜。次日,在离心速度为14 000g.4 C条件下离心30 min后取上清液备用。

注:因M86是一.种非纯化的抗体,不同批次之间的活性可能存在差异。建议在新试剂使用前先确认抗体活性既往使用批次是否有差异.必要时重新验证抗体稀释比例的合理性。

5.3ELISA抑制法检测上清液中剩余M86抗体

5.3.1固相抗原 包被板的制备

首先用去离子水将Gal a 1-3gal-BSA(如: 500 μg/ ml, GalRSA)稀释一定倍数(如:25倍),再用pH 9.5的碳酸盐缓冲液再次稀释(如:10倍) ,制备2 ug/mLCiau1l-3gal-BSA稀释溶液。取100 pμL/孔.加入酶标板.混匀后在室温温和摇动2 h,之后置于4 I孵有过夜进行包被。次日用洗液(0.05%的吐温20/PBS)洗板至少3次(伴随温和摇动,100r/min),在吸水纸上拍干。加人1%(质量浓度)的血清白蛋白200 pL/孔进行封闭,置于37 C.2.佳随温和摇动。之后再次洗板拍干备用。

注1:一次制备的Gala1-3gal- BSA包被板可C封保存,一周内使用。

注2:配制碳酸盐缓冲液:称取碳酸钠08566g碳酸氢钠0.8401g,用约80ml.超纯水溶解.在pH仪下调整至pH为9.5,定容至100 mL.

5.3.2剩余M86抗体检测

分别取100μL5.2中准备的试验样品与M86抗体反应后的反应物上清液(含有M86剩余抗体)加人固相抗原包被的96孔板中(每份样品3个复孔),用封口膜密封96孔板,置于37 C振荡孵育2 h后，用洗液洗板3次(伴随温和摇动)。加入IgM-HRP,37 C振荡孵育1 h后,用洗液洗板3次(伴随温和摇:动)。加100 μL TMB显色液避光显色15 min,用10% H2SO, 50 μL终止液显色后,在酶标仪上于450nm波长处测吸光度值。

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