YY/T 1465.1-2016 医疗器械免疫原性评价方法 第1部分:体外T淋巴细胞转化试验优质

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YY/T 1465.1-2016.Immunogenic evaluation method of medical devices一Part 1: T Lymphocyte transformation test in vitro.

5.2 动物的种属和要求

常用的实验动物为小鼠。本部分中推荐使用未进行过试验的健康的BALB/c小鼠,SPF级，6周齡~8周龄。如选用其他品系小鼠,宜对其适宜性进行说明。正式试验前要将动物至少饲养5 d .以适应实验室环境。试验动物宜标明种属、品系、来源、性别、体重和周龄。试验开始时,动物的体重差异宜控制在*小范围,每只动物的体重不能超过同性别平均体重的士20%。推荐至少采用3只小鼠。

6样品制备

按照GB/T 16886.12的原则进行试验样品制备.

注:医疗器械/材料中可能存在的免疫原多为大分子物质,宜对所选用试验样晶制备方法的有效性进行说明。MTT法

7.1 原理

MTT为一种浅黄色的细胞染料,进入活细胞的MTT在线粒体中琥珀酸脱氢酶的作用下会形成不溶于水的蓝紫色结晶甲躜颗粒并沉积在细胞中,将细胞中的甲膜溶解并用酶联免疫检测仪测定其吸光度值,可间接反映活细胞的数量和/或代谢活性。淋巴细胞在受到抗原或丝裂原刺激时,可发生特异性或非特异性免疫应答并发生增殖分化,细胞的数量或代谢活性会增加。通过MTT染料检测淋巴细胞增殖能力,即可反映医疗器槭/材料中免疫原对淋巴细胞免疫功能的影响。

注1; MTT是一种常用的检测细胞增殖的染色标志物。其他适宜的染色标志物如BrdU,MTS和CCK-8等也使用.'H-TdR是一种敏感性较高的检测细胞增殖的标志物,但实验窒应有使用放射性材料的资质并且试验人员经过相应的培训并取得合格证书。

注2:本方法适用于体外检测T淋巴细胞的增殖,不排除其他种类细胞亚群的增殖对本实验结果的干扰。

7.2 淋巴细胞制备

脱颈椎处死BALB/c小鼠,无菌取脾，研磨制备单细胞悬液,收集细胞悬液，400g离心5 min,弃上清,加5 mL红细胞裂解液,混匀, 4 C孵育5 min,加入含10%FCS的RPM11640培养液终止反.应,400g离心5 min,弃上清,加入含10%FCS的RPMI1640培养液调整细胞浓度至2X10*个细胞/mL.

7.3试验分组

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