YY/T 1465.5-2016 医疗器械免疫原性评价方法 第5部分:用M86抗体测定动物源性医疗器械中a-Gal抗原清除率优质

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YY/T 1465.5-2016.Immunogenic evaluation method of medical devices-Part 5: Determination of a-Gal antigen clearance in medical devices utilizing animal tissues and their derivatives with M86 antibody.

试验分组包括:

a)未经a-Gal抗原去除过程的材料组;

b)经a-Gal抗原去除过程的材料组;

c)阴性对照组,不含a-Gal抗原的材料;

d)试验溶剂对照组.

6.4*佳M86抗体稀释度的测定

6.4.1总则 .

不同批次M86抗体的效价可能有-定的差异，宜确定每批次M86抗体的*佳稀释度。将购买的市售M86等分成适宜体积,贮存备用。

6.4.2

aGal抗原标准品制备

取a-Gal-BSA溶于pH9.6的包被液，加人微孔板中,100 pL/孔,推荐的终浓度为1 μg/mL~10 ug/mL, 4 C条件下包被过夜,用1% BSA封闭后备用。

6.4.3 M86 抗体*佳稀释度

在每个微孔板中分别加入100μ倍比稀释的M86抗体溶液,共8个稀释度,推荐初始稀释度为1 : 25,稀释度在1: 25与1 : 3200之间。混匀,室温振荡孵育1.5 h,用洗液洗板3次。加入HRP标记的抗小鼠二抗,37C振荡孵育1h后,用洗液洗板3次。显色后,用酶标仪读取吸光度值,绘制吸光度值与对应M86稀释度的反应曲线。取反应曲线刚进人平台区稀释度的两倍浓度值作为*佳稀释度。每次使用前将贮存的M86抗体重新稀释。

6.5 M86 抗体共孵育

在每个对照品和按6.3分组初始浓度相同的各试验管中分别加入160μL6.4确定的稀释比例的M86抗体溶液,即每个反应管的总体积为200 μL。混匀,4 C震荡孵育过夜,离心管在10 000g离心5 min后取上清液备用。.

6.6间接抑制ELISA法检测.上清溶液中剩余M86抗体

在96孔板的相应孔中加入过量的a-Gal抗原溶液,100 μL/孔,4 C孵育过夜,用洗液洗板3次。分别取按6.5制备的100 μL上清液加人相应抗原包被的96孔板中,37 C振荡孵育2 h后,用洗液洗板3次。加人HRP标记的抗小鼠二抗,37 C振荡孵育1 h后,用洗液洗板3次。显色后,用酶标仪读取吸光度值.

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